高效液相色谱以其灵敏、高效快捷、液相可分离大多数液体样品等优点,色谱沙参广泛应用于中药有效成分含量测定、法测组分分析、定北指纹图谱等方面。中的蔗糖指纹紫外检测器(UV)具有高灵敏度和稳定性,图谱因此高效液相色谱中应用较为广泛,高效但是液相对于没有紫外吸收或紫外末端吸收的有机化合物,其无法检测。色谱沙参蒸发光散射检测器(ELSD)弥补了上述紫外检测器的法测不足,显示出极大的定北优越性。2020年版《中国药典》已经在黄芪、中的蔗糖指纹四季青、图谱酸枣仁、高效山银花等20种中药材的含量测定项目中使用蒸发光散射检测器。 北沙参是伞形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr.SchmidtexMiq.)的干燥根,为常用中药,可缓解口燥咽干、肺热咳嗽等病症,其主要化学成分为糖类、香豆素类、磷脂、生物碱、氨基酸、挥发油、微量元素等。有研究表明,北沙参中的糖类成分含量最高,具有较好的抗肿瘤、抗氧化以及免疫调节活性。因此对北沙参中糖类成分进行测定,可以有效评价北沙参的质量,保证临床用药有效性。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段,可从整体上鉴别评价中药材及中药制剂半成品质量的真实性、优良性、稳定性。成分测定与指纹图谱联合使用,可以全面评价中药的质量。 目前法定标准中没有北沙参的含量测定和指纹图谱检测项目,为了增强标准的可控性,笔者建立了北沙参的指纹图谱测定方法和蔗糖的含量测定方法,以期为制订北沙参质量标准奠定基础。 1 实验部分1.1 主要仪器与试剂高效液相色谱仪:Waters2695型,附带Waters2420型蒸发光散射检测器和Empower色谱工作站,美国waters公司。精密电子天平:AGBP210S型,感量为0.00001mg,德国Sartorius公司。乙腈:色谱纯,美国赛默飞世尔公司。实验所用其余试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。蔗糖对照品:50mg,编号为1507–200001,中国药品生物制品检定研究院。 北沙参药材编号和来源见表1。 1.2 对照品溶液的制备取蔗糖对照品10mg,精密称定,加水定容至10mL的量瓶中,配制成1mg/mL的蔗糖对照品溶液,摇匀,用0.45µm微孔滤膜滤过,即得。 1.3 样品溶液的制备取北沙参样品粉末(过0.42mm筛)4g,精密称定,加40%乙醇240mL,超声提取(功率250W,频率53kHz)30min,滤过,取续滤液100mL,浓缩至10mL,0.45µm微孔滤膜滤过,即得。 1.4 色谱条件谱柱:InnovalNH2色谱柱(250mm×4.6mm,5µm,北京艾杰尔科技有限公司);流动相:乙腈-水(80∶20),等度洗脱;流量:1mL/min;柱温:30℃;ELSD的漂移管温度:60℃;喷雾器加热级别:100%;气体压力:137.90kPa。 2 结果与讨论2.1 蒸发光散射检测器系统条件的优选2.1.1 正交试验因素、水平设计蒸发光散射检测器的系统条件由喷雾器加热级别、漂移管温度、气体压力和增益4个条件组成,由于增益值仅影响信号放大的程度,对检测结果没有影响,所以本试验以漂移管温度A、喷雾器加热级别B、气体压力C为3个考察因素,每个因素分别设有三个水平,通过正交试验对检测器条件进行优选,因素水平见表2。 2.1.2 正交试验方法与结果精密吸取对照品溶液10µL,注入高效液相色谱仪进行检测。以蔗糖的峰面积作为评价指标,优选条件。结果见表3~表5。 由表5可知,A、C两个因素P值均小于0.05,说明漂移管温度、气体压力这两个因素对蔗糖的测定均具有显著性意义;B因素的P值大于0.05,说明喷雾器加热级别对蔗糖的测定不具有显著性意义。根据试验结果进行直观分析,A1B3C1为最佳选择,即漂移管温度为60℃,喷雾器加热级别为100%,气体压力为137.90kPa。 2.2 色谱条件选择与色谱图氨基柱其固定相是以超纯全多孔球形硅胶为基质,通过采用独有的固定相键合技术,使用含有氨基丙基官能团的有机硅烷键合而成,能比硅胶柱更快达到平衡,对流动相的水含量没有硅胶柱敏感。氨基柱可用于极性化合物的正相分析,弱阴离子交换以及含水的反相液相分析。氨基柱柱被广泛应用于木糖、乳糖、葡萄糖等糖类的反相分析模式中。故本实验选用氨基柱作为色谱柱。 实验选用氨基柱作为色谱柱。分别吸取蔗糖对照品溶液和样品溶液各10µL,注入高效液相色谱仪检测,开启ELSD采集信号,得到蔗糖对照品和样品的蒸发光检测色谱图,见图1、图2。由图1、图2可知,对照品图谱和样品图谱中,ELSD检测到蔗糖峰在11.5min附近。 2.3 线性关系与检出限取蔗糖对照品溶液,分别进样2.5、5、10、15、20、25µL,经ELSD检测,以蔗糖进样质量的自然对数值为横坐标X,以蔗糖峰面积的自然对数值为纵坐标Y,进行线性回归计算得线性回归方程为Y=1.1180X+11.86(r=0.9997),结果表明,蔗糖进样质量在7.30~72.95µg范围内线性关系良好。将蔗糖对照品溶液逐级稀释,分别进样分析,以3倍信噪比计算检出限,计算得检出限为0.02mg/mL。 相关链接:乙腈,蔗糖,木糖,氨基酸
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